Kromatografi
merupakan teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan distribusi dan
komponen diantara dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Prinsip kerjanya
yaitu memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan
pelarut yang digunakan. Fasa diam yang digunakan pada percobaan ini yaitu
berbentuk plat silika dengan fasa gerak berupa larutan kombinasi n-heksana dan
etil asetat dengan perbandingan 2:1. Campuran larutan ini dinamakan eluen. Semakin
dekat kepolaran dengan sampel dan eluen, maka sampel akan terbawa oleh fasa
gerak tersebut. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, komponen
terdistribusi ke dalam dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa gerak
adalah campuran yang berperan sebagai larutan yang dapat membawa sampel dan
mampu menarik sampel yang dibutuhkan pada plat TLC. Perbandingan campuran
bertujuan untuk membedakan kecepatan perpindahan masing-masing komponen
diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Plat TLC yang digunakan telah
dipotong dengan ukuran 5x3 cm, kemudian plat TLC diberi garis pinggir, yaitu
0,5 cm pada tepi atas dan tepi bawah, dimana garis ini digunakan untuk tempat
menotolkan sampel yang akan digunakan.
Berdasarkan percobaan
yang telah dilakukan, kami menggunakan 10 jenis sampel, yaitu ekstrak bayam, ekstrak
nanas, ekstrak naga, ekstrak wortel, ekstrak tomat, ekstrak bunga sepatu,
ekstrak pepaya, ekstrak kentang, ekstrak bunga kertas dan ekstrak semangka. Pada
plat TLC yang pertama menggunakan empat sampel, yaitu buah naga, bayam, buah
nanas dan bunga kertas dengan kami kasih nama sampel berturut-turut a, b, c, dan
d. Lalu dilakukan penotolan sampel pada plat TLC dengan menggunakan pipa
kapiler pada garis tepi bawah. setelah semua sampel selesai ditotolkan pada
plat TLC, lalu plat tersebut dimasukkan dalam chamber yang berisi n-heksana dan
etil asetat dengan perbandingan 2:1 atau 2 ml dan 1 ml. Kemudian plat TLC
dimasukkan dan jangan sampai garis tepi bawah terkena oleh larutan, lalu
chamber ditutup agar tidak terjadi penguapan pada larutan. Setelah itu,
diperhatikan eluen yang bergerak pada plat TLC hingga eluen berhenti bergerak. Kemudian
dilihat dan diletakkan plat TLC di bawah sinar UV agar noda pada plat TLC dapat
dilihat secara jelas dan lebih mudah mengukur jarak tempuh pada noda dan jarak
tempuh pelarut sehingga dapat menentukan nilai Rfnya. Nilai Rf adalah nilai
perbandingan jarak yang ditempuh suatu noda terhadap jarak yang ditempuh oleh
pelarut.
Pada plat TLC
pertama diperoleh hasil noda yang ditempuh pelarut yaitu 4, cm dan noda yang
ditempuh pada sampel a yaitu 3,9 cm, jarak noda sampel b yaitu 0,3 cm, jarak
tempuh noda c yaitu 3,8 cm, dan jarak noda d yaitu 2,5 cm. Maka setelah didapat
jarak tempuh larutan dan jarak tempuh noda bisa menhitung nilai Rfnya. Didapatlah
nilai Rfnya sampel a, b, c, d secara berturut-turut yaitu 0,8 cm, 0,06 cm, 0,7
cm dan 0,5 cm.
Selanjutnya kami melakukan kembali pada plat TLC yang
kedua dengan sampel yang berbeda yaitu, ekstrak semangka, ekstrak wortel,
ekstrak pepaya, dan ekstrak kentang dengan nama berturut-turut e, f, g, dan h. Pada
plat kedua ini kami mendapat jarak tempuh pelarut yaitu 4,5 cm dan noda yang
ditempuh pada sampel e yaitu 3,7 cm, jarak tempuh noda f yaitu 3,9 cm, jarak
tempuh noda g yaitu 3,8 cm, dan jarak tempuh noda h yaitu 0 atau tidak
bergerak. Dan didapat nilai Rfnya berturut-turut yaitu 0,82 cm, 0,86 cm, 0,84
cm dan 0 cm.
Kamudian kami
melakukan kembali pada plat TLC ke tiga yaitu dengan sampel ekstrak tomat dan
ekstrak bunga sepatu dengan nama berturut-turut i, dan j. Jarak yang ditempuh
pelarut pada plat ini adalah 4,7 cm. Lalu jarak noda yang ditempuh pada sampel
i dan j berturut-turut yaitu 4,1 cm dan 4 cm. Sehingga didapat nilai Rfnya
yaitu 0,87 cm dan 0,85 cm.
Berdasarkan hasil
percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa semakin polar sampel
yang digunakan maka sampel akan bergerak lambat atau jarak yang ditempuh kecil sedangkan
jika semakin tinggi atau semakin besar jarak yang ditempuh noda/sampel maka sampel
tersebut bersifat nonpolar.
8.2 Kromatografi kolom
Kromatografi kolomk merupakan teknik pemisahan
kromatografi yang menggunakan kolom yang terbuat dari kaca atau tabung reaksi. Dalam
kromatografi ini juga terdapat dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam
yang digunakan pada percobaan ini yaitu silika gel, sedangkan fasa gerak yang
digunakan yaitu eluen. Pada percobaan ini juga menggunakan 10 sampel, yaitu
ekstrak buah naga, ekstrak buah nanas, ekstrak tomat, ekstrak bunga sepatu,
ekstrak daun bayam, ekstraks pepaya, ekstrak kentang, ekstrak semangka, ekstrak
wortel, dan ekstrak bunga kertas. Dan eluen yang digunakan yaitu, n-heksana,
etil asetat, etanol, dan kloroform.
Langkah pertama
yaitu siapkan kolom kromatografi yang akan digunakan. Lalu sumbat kolom dengan
menggunakan kapas, kemudian kolom tersebut diteteskan n-heksana sedikit demi
sedikit yang fungsinya untuk membersihkan dinding-dinding kolom yang mana ada kapas
yang menempel. Lalu dimasukkan silika gel ke dalam kolom, lalu kolom
diketuk-ketuk agar silika gel memadat pada setengah kolom. Setelah kolom siap
digunakan, masukkan sedikit sampel yang akan diuji yang sebelumnya ditambahkan
sedikit silika gel. Kemudian masukkan pelarut ke dalam kolom kromatografi
sesuai dengan sifat kepolaran sampel. Ketika sampel turun, pelarut ini harus terus menerus ditambahkan. Pelarut yang
menetes di tampung dalam botol kecil. Selanjutnya hasil tetesan ini pada setiap
botolnya di tambahkan dengan 1 tetes methanol dan kemudian di totolkan di atas
plat TLC lagi totolan pertama adalah crudenya dan totolan selanjutnya adalah
sesuai botol hasil tetesan tadi.
1.
Sampel ekstrak buah naga
Pada sampel
ini digunakan pelarut yaitu campuran n heksane dan etil asetat dengan dengan 3 kali perbandingan. Yang pertama dilakukan dengan perbandingan 8 : 1 ketika menggunakan perbandingan ini sampel tidak turun
sama sekali. Selanjutnya digunakan pelarut dengan perbandingan 16 : 2 sampel
hanya turun sedikit dan terakhir digunakan perbandingan 15 : 5 sampel hanya
turun sedikit juga. Dari sini di dapat larutan yang menetes sebanyak 5 botol
dan semua botol berwarna bening. Selanjutnya sampel pada botol ini ditutup dengan aluminium foil dan diberi lubang-lubang kecil dan dibiarkan
selama seminggu. Karena larutsn tersebut mudah menguap dan membuat botol menjadi
kering, jadi setiap botol diteteskan dengan methanol. Lalu ditotolkan lagi ke atas plat
TLC dan di masukkan lagi ke dalam chamber dengan larutan adalah n-heksana dan etil asetat dengan
perbandingan 3 : 2 dan pada TLC dapat dilihat bahwa hanya crude saja yang
bergerak, botol 1, 2, 3, 4, dan 5 tidak ada sampel yang
bergerak dan tak terlihat nodanya.
2.
Sampel ekstrak daun bayam
Pada sampel
ini digunakan pelarut n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 5 : 10
dan di dapat 5 botol hasil tetesan. Pada botol 1 berwarna bening, botol 2 berwarna hijau, botol 3 berwarna
hijau tetapi sudah mulai pudar, dan botol 3 dan 4 warna nya bening. Selanjutnya dilakukan kromatografi tipis, dengan prosedur yang sama
dengan sampel buah naga. Ditotolkan di
atas plat TLC dan di rendam dalam larutan yaitu masih n-heksan dan etil asetat dengan
perbandingan 3 : 2. Dan pada plat TLC tidak ada sampel yang bergerak tetapi pada batas garis hasil totolan
botol 1, 2, 3, 4, dan 5 berwarna kuning layu.
3.
Sampel ekstrak buah nanas
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan yaitu kloroform dan methanol dengan perbandingan 3 : 1 dan di dapat 3 botol. Pada
botol 1 berwarna bening, botol 2 warnanya keruh, dan pada botol 3 hasil tetesan
bening kembali. Selanjutnya dilakukan
kromatografi lapis tipis, dengan prosedur sama dengan yang sebelumnya. Ketika ditotolkan ke atas plat TLC tidak ada sampel yang bergerak dikarenakan pada saat kromatografi kolom silika gelnya pecah dan
menyebabkan hasil tidak sempurna.
4.
Sampel ekstrak bunga kertas
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan yaitu kloroform dan didapat 5 botol tetesan. Pada botol 1 warna bening,
botol 2 bening seperti ada minyak, pada botol ke 3 berwarna keruh
dan pada botol 4 dan 5 warnanya bening. Selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Dan ketika ditotolin ke atas TLC hanya crude saja yang bergerak.
5.
Sampel ekstrak buah semangka
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 3 : 2 dan di dapat 3 botol
tetesan. Pada botol 1 warna bening,
botol 2 kuning pudar. Pada botol ke 3
warnanya bening. Selanjutnya dilakukan
kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Dan ketika di totolin ke atas TLC dengan larutan n-heksana dan etil asetat perbandingan
3 : 2 hanya crude saja yang bergerak dan berwarna kuning pudar.
6.
Sampel ekstrak wortel
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 3 : 2 dan di dapat 3 botol
tetesan pada botol 1 warna bening, botol 2 kuning dan pada botol ke 3 warnanya bening. Dan
ketika di totolin ke atas TLC dengan larutan pengembang n heksan dan etil
asetat perbandingan 3 : 2 crude bergerak dan berwarna kuning, pada botol ketiga
tidak bergerak tetapi pada garis ada warna kuning pudar.
7.
Sampel ekstrak pepaya
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan adalah n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 3 : 2 dan didapat 4 botol
tetesan. Pada botol 1 warna bening,
botol 2 kuning dan sampel mulai turun, dan pada botol ke 3 dan 4 warnanya bening. Selanjutnya dilakukan
kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Dan ketika di totolin ke atas TLC dengan larutan n-heksana dan etil asetat perbandingan
3 : 2 crude bergerak dan berwarna sedikit orange, pada botol kedua tidak
bergerak tetapi ada warna krim pudar pada botol ketiga bergerak yang berwarna krim dan botol ke 4
tidak bergerak dan ada warna kuning pudar.
8.
Sampel ekstrak kentang
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan adalah pelarut kloroform dan methanol
dengan perbandingan 3 : 1 dan didapat 4 botol. Pada botol 1 berwarna bening,
botol 2 kuning pudar dan botol 3 dan 4 juga berwarna bening. Selanjutnya dilakukan
kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Ketika ditotolkan ke
atas plat TLC tidak ada sampel yang bergerak tetapi pada crude ada warna abu-abu.
9.
Sampel ekstrak tomat
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan adalah digunakan
pelarut n-heksan dan
etil asetat dengan perbandingan 3 : 1
dan didapat 3 botol tetesan. Pada botol 1 warna bening, botol 2 kemerahan dan pada botol ke 3 warnanya bening. Selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Dan ketika ditotolin ke atas TLC dengan larutan n-heksana dan etil asetat perbandingan
3 : 2 hanya botol ketiga saja yang bergerak dan berwarna abu-abu.
10.
Sampel ekstrak bunga sepatu
Pada sampel
ini pelarut yang digunakan adalah pelarut n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 3 : 1 dan didapat 3 botol
tetesan pada botol 1 warna bening, botol 2 keruh dan pada botol ke 3 warnanya keruh pudar. Selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis, dengan prosedur yang dengan yang sebelumnya. Dan ketika ditotolin ke atas TLC dengan larutan n-heksana dan etil asetat perbandingan
3 : 2 tidak ada yang bergerak tetapi hanya crude yang berwarna kuning pudar pada garis.
IX. Pertanyaan Pasca
1.
berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, apa prinsip dari pengujian
kromatografi kolom?
2.
Pada percobaan yang telah dilakukan, apa fungsi dari sinar UV?
3.
Mengapa pada saat dilakukan kromatografi, wadah yang digunakan atau chamber
perlu ditutup?
X. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang
dilakukan maka dapat disimpulkan;
1.
Kromatografi merupaka teknik pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan
kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Prinsipnya berdasarkan
pada pendistribusian zat diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak.
2.
Plat TLC dibuat dengan memotong plat TLC sesuai dengan ukuran yang
dibutuhkan. Pada percobaan ini menggunakan plat TLC dengan ukuran 5x3 cm, dan
diberi garis 0,5 pada tepi atas dan tepi bawah. Lalu untuk kromatografi kolom,
kita harus menyiapkannya terlebih dahulu dengan menyumbat kolom dengan kapas,
hal ini bertujuan untuk menyumbat agar silika gel tidak ikut turun.
3.
Pertama sampel yang digunakan dilakukan dengan teknik kromatografi lapis
tipis setelah noda terlihat dapat mengetahui pelarut apa yang cocok untuk
digunakan dalam kromatografi kolom, sehingga harus dilakukan kromatografi lapis
tipis dahulu untuk mendapatkan senyawa yang murni.
4.
Kromatografi kolom dalam dilakukan untuk pemisahan pigmen tumbuhan dengan
cara mengekstrak tumbuhan itu terlebih dahulu. Lalu digunakan pelarut yang
sesuai, dan dilakukan kromatografi kolom dengan menggunakan fasa diamnya silika
gel.
XI. Daftar Pustaka
Gritter. 2013. Dasar Pemurnian Material Kimia Kromatografi.
Jurnal Kimia. Vol. 1 No.1
Syahmani,
dkk. 2017. Penggunaan Kitin Sebagai
Alternatif Fase Dian Kromatografi Lapis Tipis Dalam Praktikum Kimia Organik.
Vol. 32. No. 1
Watson, D. 2005. Analisis Farmasi Edisi Kedua. Jakarta:
Buku Kedokteran EGC.
Tim Kimia Organik. 2019. Penuntun Praktikum Kimia Organik I. Jambi:
Universitas Jambi.
